楊樹(shù) (Populus) 是重要的造林樹(shù)種，也是研究林木基礎(chǔ)生物學(xué)性狀的模式材料。此外楊樹(shù)可與多種真菌 (外生菌根真菌、叢枝菌根真菌和內(nèi)生真菌)類(lèi)群建立共生關(guān)系。目前，在楊樹(shù)-真菌互作體系中，通過(guò)構(gòu)建楊樹(shù)-雙色蠟?zāi)?(Laccaria bicolor) 和卷緣樁菇 (Paxillus involutus) 互惠共生提高楊樹(shù)非生物脅迫能力的生理機(jī)制方面的研究已取得多項(xiàng)突破，而關(guān)于楊樹(shù)-根系內(nèi)生真菌互作的研究較少。我們構(gòu)建了楊樹(shù)-根系真菌悉生共生體系，為揭示樹(shù)木和根系真菌之間互惠共生機(jī)制提供理想模型。該體系能夠基于不同目的使用不同培養(yǎng)容器來(lái)研究真菌對(duì)樹(shù)木的影響，這在現(xiàn)有的樹(shù)木-外生菌根共生體系中很少見(jiàn)。構(gòu)建楊樹(shù)-真菌互作體系是研究一系列如共生真菌侵染結(jié)構(gòu)觀察、互作轉(zhuǎn)錄組研究等生物學(xué)問(wèn)題的關(guān)鍵，并且有助于加深理解共生真菌對(duì)林木表型和生理代謝的表觀遺傳學(xué)調(diào)控機(jī)制。
 

實(shí)驗(yàn)步驟

一、真菌材料的準(zhǔn)備

1.菌餅接種劑準(zhǔn)備

       1.PDA培養(yǎng)基滅菌后取出，室溫下放置，待培養(yǎng)基溫度約45 °C后，倒入15 ml PDA培養(yǎng)基至一次性塑料培養(yǎng)皿中，待培養(yǎng)基凝固后（約1 h后），進(jìn)行接種處理。

       2使用接種針從純培養(yǎng)真菌菌落邊緣挑取菌塊，接種至PDA固體培養(yǎng)基表面，置于培養(yǎng)箱26 °C黑暗條件下培養(yǎng)。

       3.待培養(yǎng)7 d后，自菌落邊緣使用打孔器 (直徑7 mm) 取菌餅作接種劑。

二、楊樹(shù)幼苗無(wú)性系組培擴(kuò)繁

1.楊樹(shù)無(wú)性系組培苗生根培養(yǎng)和繼代繁殖

       采用組培快繁的方法在短期內(nèi)獲得優(yōu)質(zhì)楊樹(shù)無(wú)菌幼苗。以美洲黑楊雜交優(yōu)良無(wú)性系NL895楊 (Populus deltoides×P. euramericana cv. ‘Nanlin895’，NL895) 和毛白楊 (P. tomentosa) 為例。

       1.超凈工作臺(tái)紫外消毒后，將楊樹(shù)組培苗幼莖 (帶葉片)剪斷，高度約為2 cm，轉(zhuǎn)接至改良MS (秦媛，2017) 生根培養(yǎng)基 (配方見(jiàn)表1)中，使組培苗直立，并盡量避免葉片碰到培養(yǎng)基，每個(gè)組培瓶扦插3-4株幼莖，蓋上組培瓶蓋。轉(zhuǎn)移到組培室中，保持溫度25 °C，濕度60 %，設(shè)置光周期12 h (光照強(qiáng)度為20, 000 Lx)。

       2.幼苗生根培養(yǎng)3周左右，苗高達(dá)到5-6 cm后，將組培苗取出進(jìn)行繼代繁殖。操作步驟同上。然后選取根系大小、發(fā)達(dá)程度和株高 (5-6 cm)較一致的無(wú)菌幼苗，進(jìn)行共培養(yǎng)接種實(shí)驗(yàn)。

三、楊樹(shù)無(wú)菌幼苗-根系真菌互作體系構(gòu)建

1.大培養(yǎng)皿共培養(yǎng)體系

       1.超凈工作臺(tái)紫外消毒后，無(wú)菌大培養(yǎng)皿 (直徑150 mm)中倒入100 ml楊樹(shù)-真菌共培養(yǎng)培養(yǎng)基，使培養(yǎng)基在大培養(yǎng)皿中凝固后呈斜面 (如圖1所示)。

       2.將挑選的根系和株高較為均一的楊樹(shù)無(wú)菌幼苗用鑷子輕輕取出，用無(wú)菌水小心洗除幼苗根部的瓊脂，轉(zhuǎn)接至大培養(yǎng)皿共培養(yǎng)基表面，每皿3株幼苗。使無(wú)菌苗根系貼附于共培養(yǎng)培養(yǎng)基表面，地上部分放置于不含共培養(yǎng)基的一側(cè) (如圖1所示)，用封口膜進(jìn)行密封，防止污染。然后轉(zhuǎn)移至70L光照培養(yǎng)箱中，25 °C，設(shè)置光周期12 h (光照強(qiáng)度為20, 000 Lx)，培養(yǎng)7 d。

       3.待培養(yǎng)7 d后，將步驟一中獲得的菌餅接種劑，隨機(jī)挑取5個(gè)均勻轉(zhuǎn)接至根系周?chē)?(菌餅距皿壁約1.5 cm，如圖1所示)，對(duì)照組接種無(wú)菌PDA瓊脂塊，用封口膜進(jìn)行密封，防止污染。再次轉(zhuǎn)移至光照培養(yǎng)箱中，25 °C，設(shè)置光周期12 h (光照強(qiáng)度為20, 000Lx)，繼續(xù)培養(yǎng)。根據(jù)自身實(shí)驗(yàn)要求設(shè)計(jì)共培養(yǎng)時(shí)間，然后取樣進(jìn)行生理指標(biāo)的測(cè)定。

2.大試管共培養(yǎng)體系

超凈工作臺(tái)紫外消毒后，無(wú)菌玻璃大試管 (直徑25 mm，長(zhǎng)度240 mm，瓶口帶透氣硅膠塞)中倒入60 ml楊樹(shù)-真菌共培養(yǎng)培養(yǎng)基，待培養(yǎng)基凝固后待用。將步驟二挑選的根系和株高較為均一的楊樹(shù)無(wú)菌幼苗用鑷子輕輕取出，放入裝有無(wú)菌水的玻璃大培養(yǎng)皿中，小心洗除根部的瓊脂，并用無(wú)菌濾紙吸干表面水份后，轉(zhuǎn)接至大試管共培養(yǎng)培養(yǎng)基表面，并使無(wú)菌苗根系貼附于共培養(yǎng)培養(yǎng)基表面 (如圖2所示)。大試管瓶口用透氣硅膠塞封口，并在透氣硅膠塞上蓋一層錫箔紙，再用塑料保鮮膜進(jìn)行密封，防止污染。而后，轉(zhuǎn)移至70L光照培養(yǎng)箱中，25 °C，設(shè)置光周期12 h (光照強(qiáng)度為20,000 Lx)，培養(yǎng)7 d。待培養(yǎng)7 d后，接種真菌菌株，每株無(wú)菌幼苗僅接種1個(gè)菌餅。

注：大培養(yǎng)皿體系主要目的是用于直觀的觀測(cè)根系內(nèi)生菌對(duì)樹(shù)木根系的促生作用，而大試管體系的目的是使根系內(nèi)生菌*侵染根系后可用于盆栽試驗(yàn) (耐鹽、耐旱等)。

從大培養(yǎng)皿楊樹(shù) (NL895楊)-真菌共培養(yǎng)體系和培養(yǎng)21天后的NL895楊生長(zhǎng)狀態(tài)能看出該菌株能夠顯著促進(jìn)NL895楊根系的生長(zhǎng)發(fā)育，培養(yǎng)7天后的毛白楊生長(zhǎng)狀態(tài)，可以看出該菌株可以顯著提高毛白楊的鉀離子吸收，這些就是楊樹(shù)根系真菌互作體系構(gòu)建方法，如果還有什么疑問(wèn)，歡迎聯(lián)系上海喆圖科學(xué)儀器有限公司。