植物組織培養(yǎng)有兩個(gè)核心的步驟，那就是野生材料馴化和組織形態(tài)建成。
野生材料的馴化
很多時(shí)候，需要使用植物組織培養(yǎng)往往是出于遺傳轉(zhuǎn)化受體的需要，抑或是進(jìn)行不同條件的培養(yǎng)以提取代謝物進(jìn)行差異分析，出于這樣的前提，實(shí)驗(yàn)者往往只是搬照文獻(xiàn)里給出的培養(yǎng)條件或者做出明確的改動(dòng)，缺乏的只是材料。
因此，無(wú)菌培養(yǎng)是這一類組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)的保障，而將野生材料馴化的過(guò)程，即是無(wú)菌操作與外植體消毒等一系列與污染作斗爭(zhēng)的集中體現(xiàn)。
野生材料馴化的具體措施如下：
1. 滅菌：
通常，我們需要對(duì)使用的培養(yǎng)基、培養(yǎng)皿、鑷子、解剖刀、去離子水和濾紙進(jìn)行*的滅菌，這樣可以*殺死器材和培養(yǎng)基中的微生物；
其中，培養(yǎng)基、鑷子、解剖刀、去離子水等液體和金屬器皿通常采用121℃ 20-30min的濕熱滅菌法，玻璃器皿常用180℃ 2h的干熱滅菌法，而抗生素、激素等不耐高溫的試劑常用過(guò)濾滅菌法。
2. 消毒：
消毒是指外植體和操作臺(tái)面的消毒，目的是在不傷害植物的前提下，抑制和殺死大部分微生物。其中，外植體消毒的方式主要分為表面消毒和侵入消毒兩種，對(duì)于操作臺(tái)面的消毒通常是指超凈工作臺(tái)使用前進(jìn)行的的30min紫外燈消毒和操作過(guò)程中的空氣濾過(guò)消毒，值得一提的是，在使用超凈臺(tái)之前用70 % 酒精擦拭臺(tái)面會(huì)有一定效果。
對(duì)于大部分種子、陸生植物的莖葉等，表面消毒足以殺死可能會(huì)在組織培養(yǎng)過(guò)程中導(dǎo)致污染的微生物，比如70 % 乙醇、5 % 過(guò)氧化氫，均可以在短時(shí)間內(nèi)有效殺死表面的微生物；
但對(duì)于一些生長(zhǎng)在潮濕陰暗環(huán)境中的植物來(lái)說(shuō)，通常有著大量的組織內(nèi)生菌，而這些內(nèi)生菌往往不是表面消毒可以殺死的，一些侵入式消毒劑會(huì)比較有效，如HgCl2、次氯酸鈉等。
3. 無(wú)菌操作：
無(wú)菌操作即杜絕一切來(lái)自操作者的污染或因操作者失誤導(dǎo)致的其他污染，一些常見的操作手法如下：
a) 設(shè)立單獨(dú)的組培間，并設(shè)立與外界污染區(qū)的緩沖間，在緩沖間內(nèi)更衣進(jìn)入組培間；
b) 進(jìn)入組培間前要在緩沖間內(nèi)進(jìn)行全身的酒精噴霧消毒，同時(shí)換上組培室拖鞋；
c) 操作過(guò)程中，佩戴手套或肢體不從一切開口器皿的上方經(jīng)過(guò)；
d) 器皿不要遮蓋超凈臺(tái)出風(fēng)口，超凈臺(tái)不要開口太大；
e) 在超凈臺(tái)中點(diǎn)燃酒精燈，操作盡量在酒精燈火焰周圍進(jìn)行；
f) 使用的金屬工具和玻璃器皿每進(jìn)行一階段的操作后及時(shí)進(jìn)行灼燒滅菌；
g) 鑷子、槍頭等接觸培養(yǎng)基的工具在接觸到其他固態(tài)表面后立即灼燒滅菌或更換；
h) 做其他分子實(shí)驗(yàn)的超凈臺(tái)應(yīng)與進(jìn)行組織培養(yǎng)接種的超凈臺(tái)分開；
4. 富內(nèi)生菌類型的野生材料的馴化
部分野生材料難以實(shí)現(xiàn)有效的消毒，即便是兩種消毒方法復(fù)合使用也收效甚微，此時(shí)應(yīng)使用試管苗培養(yǎng)的方法，大批量接種培養(yǎng)，經(jīng)過(guò)兩周后篩選未污染的植株再進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，此方法可有效馴化野生植株獲得無(wú)菌系，一些苔蘚植物常用這樣的方法。注意，在培養(yǎng)過(guò)程中一旦發(fā)生污染，整個(gè)培養(yǎng)基的植株都應(yīng)該丟棄。
如果與內(nèi)生菌的斗爭(zhēng)過(guò)于艱難，可以嘗試使用組織培養(yǎng)抗菌劑PPM，這是一種廣譜的抗菌劑，但是也會(huì)對(duì)某些植物有著抑制效果，建議在馴化獲得無(wú)菌系之后停止使用。
組織形態(tài)建成
在一些其他的時(shí)候，我們需要對(duì)一些從未進(jìn)行過(guò)組織培養(yǎng)的植物進(jìn)行人工的繁育，以適應(yīng)實(shí)驗(yàn)的需求，在這個(gè)時(shí)候，我們往往需要自己進(jìn)行組織形態(tài)建成的探究。
正確的改變培養(yǎng)條件，是建成想要的組織形態(tài)的一種策略。
首先要說(shuō)明的是，在更換培養(yǎng)基的時(shí)候，需*清除殘余的培養(yǎng)基并將植株剪切或者其他方式進(jìn)行處理后移到新的培養(yǎng)基上，否則殘余的培養(yǎng)基將影響植株的狀態(tài)。
其次，有哪些培養(yǎng)條件可以通過(guò)設(shè)備進(jìn)行人為的改變呢？
- 光照的強(qiáng)度、光質(zhì)與光照時(shí)間；
- 培養(yǎng)基的無(wú)機(jī)成分、有機(jī)成分，尤其是生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑；
- 培養(yǎng)基的PH值；
- 培養(yǎng)基的一些添加劑；
- 人工氣候箱培養(yǎng)的溫度、濕度、培養(yǎng)瓶通氣性等；
下面，我們對(duì)這些條件進(jìn)行逐條的解析：
當(dāng)發(fā)生以下問(wèn)題時(shí)，需要考慮光照因素：
誘導(dǎo)營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)與生殖生長(zhǎng)——光質(zhì)、光周期，遠(yuǎn)紅光通?？烧T導(dǎo)生殖生長(zhǎng)；
組織褐變率高——光強(qiáng)過(guò)強(qiáng)、光照時(shí)間過(guò)長(zhǎng)；
葉片黃化或生長(zhǎng)速度慢——光照不足；
植物組織培養(yǎng)的培養(yǎng)基通常需要考慮添加以下成分：
- 無(wú)機(jī)鹽成分——其中，氨態(tài)氮、硝態(tài)氮的比例和組織的脫分化與再分化有關(guān)，F(xiàn)e、Mg與葉綠素生成有關(guān)、Ca與愈傷組織生長(zhǎng)有關(guān)，還有很多針對(duì)不同植物特殊需求而添加的元素，等等；
- 瓊脂等固相支持物——與培養(yǎng)基的凝固能力有關(guān)，通常添加0.8 % - 1.2 %的瓊脂即可滿足實(shí)驗(yàn)需要；
- 蔗糖、葡萄糖等碳源——與組織的生長(zhǎng)速度有關(guān)，通常不會(huì)影響組織的形態(tài)，一般添加0.5 % - 4 %，通常2 % 的蔗糖可供組織吸收一個(gè)月；
- 維生素、煙酸、肌醇等其他有機(jī)成分——可促進(jìn)胚狀體的形成，協(xié)助組織進(jìn)行各項(xiàng)代謝；
- 培養(yǎng)基PH的影響：
培養(yǎng)基PH不適宜可能導(dǎo)致組織褐變和玻璃化，但不同植物對(duì)PH的敏感性不同，如苔蘚植物對(duì)培養(yǎng)基PH的敏感性較低，而一些單子葉植物則對(duì)培養(yǎng)基PH十分敏感。
活性炭可吸收受傷的植物組織產(chǎn)生的酚類，同時(shí)保護(hù)易降解的植物激素，在容易發(fā)生褐變與玻璃化的組織培養(yǎng)馴化過(guò)程中，可以嘗試在培養(yǎng)基中加入活性炭，一般1 g/L。
椰奶、洋蔥、土豆泥、香蕉泥、胡蘿卜汁等添加成分，其化學(xué)成分不*清楚，但往往具有著一定的調(diào)節(jié)作用，諸如香蕉泥可以穩(wěn)定PH有利于壯苗、土豆泥可以補(bǔ)充維生素有利于生根等。
- 培養(yǎng)箱的一些環(huán)境參數(shù)：
培養(yǎng)箱的環(huán)境尤其溫度會(huì)對(duì)植物培養(yǎng)造成一定的影響，一般植物組織培養(yǎng)可使用人工氣候培養(yǎng)箱在23 – 27 ℃的溫度區(qū)間。在一定范圍內(nèi)，濕度、通氣性等條件通常不會(huì)對(duì)組織造成關(guān)鍵性的影響。
- 特別地，植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑在組織培養(yǎng)中的關(guān)鍵作用：
植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑可分為生長(zhǎng)素類、細(xì)胞分裂素類、赤霉素、特殊調(diào)節(jié)劑類四種。
生長(zhǎng)素類通?？梢哉T導(dǎo)植物組織生根、生芽，與細(xì)胞分裂素類搭配可以使高等植物向生芽、生根和保持愈傷組織狀態(tài)生長(zhǎng)，而低等的苔蘚植物沒(méi)有根莖葉的明顯分化，其形態(tài)建成較為復(fù)雜。通常，IBA與NAA、IAA造成的效果相似但相對(duì)更強(qiáng)，2，4-D造成的效果與另外三種生長(zhǎng)素有著顯著不同。細(xì)胞分裂素可顯著提高愈傷組織的生長(zhǎng)速度，但對(duì)低等植物效果不明顯。
特殊調(diào)節(jié)劑，如酚噻隆、PSK等，具有著強(qiáng)烈的調(diào)節(jié)效果但機(jī)理尚不明確，可在培養(yǎng)基中嘗試添加。
植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑是MAX重要的組織形態(tài)建成的方式，在植物組織培養(yǎng)中添加不同的激素不僅可以改變植物生長(zhǎng)的特性，還可能改變植物的次生代謝特征，因此研究激素對(duì)某種或某類植物的影響是一項(xiàng)有意義的科研問(wèn)題。
